检测技术简介您当前的位置:首页 > 检测技术简介

考核项目六  粪便中寄生虫卵检查技术

【学习目的和要求】

1.掌握线虫卵的特征。

2.掌握漂浮法和沉淀法两种操作技术。

【器材】 铁架台、漏斗、铜筛网、烧杯、三角烧瓶、载玻片、盖玻片、牙签等

家禽患寄生虫病后,除少数呈现典型症状外,家禽的多数寄生虫病在临床上仅表现消化机能障碍、消瘦、贫血、营养不良和发育受阻、生产性能降低等慢性、消耗性疾病的症状,虽不具特异性,但可作为早期发现疫病的参考。

调查寄生虫病的流行因素,了解发病情况,摸清寄生虫病的传播和流行动态,为确立诊断提供依据。

实验室诊断实验室诊断是确诊寄生虫病的重要依据,主要包括如下内容:

一、粪便内虫卵检查法  

粪便检查是寄生虫病生前诊断的最基本、最常用的方法。多种寄生虫如吸虫、绦虫、线虫、棘头虫、球虫等,寄生于畜禽的消化系统或呼吸系统,某一发育阶段的病原体,常随畜禽的粪便排出,因此,检查粪便发现有寄生虫的虫卵、幼虫、虫体或虫体断片,可确诊畜禽消化系统(包括肝脏)、呼吸系统和泌尿生殖系统的寄生虫病。

粪便内虫卵检查法分直接涂片检查法和集卵法。

(一)直接涂片检查法

是最简便和常用的方法,但是,当畜禽体内寄生虫数量不多而粪便中虫卵少时,有时不能查出虫卵。

本法是在载玻片上滴一些50%甘油或清洁常水的等量混合液,再用镊子或牙签挑取少量粪便加入其中,混匀,夹去较大的或过多的粪渣,最后使玻片上留有一层均匀的粪液,其浓度的要求是将此玻片放于报纸上,能通过粪便液膜模糊地辨认其下的字迹为合适。在粪膜上覆以盖玻片,置低倍显微镜下检查。检查时,应顺序地查遍盖玻片下的所有部分。该法简便易行,适用于检查各种蠕虫的虫卵、球虫卵囊等,但检出率较低。

(二)集卵法

1.沉淀法

该法的原理是虫卵比水重,可自然沉于水底,便于集中检查和提高检出率。主要用于吸虫卵和棘头虫卵的检查,也可用于其他寄生虫卵和球虫卵囊等的检查。

方法:取粪便510g置于烧杯中,加清水100ml以上,搅匀成粪汁,通过260~250μm40~60目)铜筛或两层纱布过滤,滤液收集于另一三角烧瓶或烧杯中,静置沉淀20~40min,倾去上层液,保留沉渣。再加水混匀,再沉淀,如此反复操作直到上层液体透明后,用滴管或吸管吸取沉渣滴于载玻片上,加盖玻片后镜检。也可将粪便滤液置离心管中,以每min2500~3000转离心沉淀3~5min,取出后倾去上层液,再加水搅合,离心沉淀,如此反复操作,直到上层液透明为止,最后倒掉上清液,取沉淀物制片镜检。制片厚度要求同直接涂片法。此法适用于检查吸虫卵。

2.漂浮法

该法的原理是利用比虫卵比重大的溶液作为检查用的漂浮液,使寄生虫的虫卵、球虫卵囊等浮聚于液体表面,取表膜液制片镜检,以提高检出率。该法适用于检查粪便中的线虫卵、绦虫卵和球虫卵囊。

方法:取5~10g粪便置于100ml烧杯中,加入少量饱和盐水搅拌混匀后,继续加入10~20倍的饱和盐水,用玻棒搅匀,通过250μm60目)细网筛或两层纱布过滤,将滤液置平底试管内,静置30min左右,则虫卵上浮;用直径0.5~1.0cm的金属圈平着接触滤液表面,提起后将粘于金属圈上的液膜抖落于载玻片上,如此多次蘸取不同部位的液面后,加盖玻片镜检。此法适用于线虫卵的检查。

也可取粪便1g,加饱和食盐水10ml,混匀,筛滤,滤液注入直立的直径1.5~2cm的平口试管或青霉素瓶中,补加饱和盐水溶液使试管充满,然后用滴管补加粪液,滴至液面凸出管口为止,管口覆以清洁盖玻片,并使液体和盖玻片接触,其间不留气泡,直立半小时后,平移此盖玻片于事先放有一滴甘油水的载玻片上镜检。

也可将粪便滤液置离心管内,按每min2500~3000转离心漂浮5~10min,取上浮物制片镜检。

以上漂浮法和沉淀法,均使液体静置待其自然下沉或上浮。也可将以上粪液置于离心管中,在离心机内离心,借助离心力以加快其沉淀或上浮过程。

常用的漂浮液:  

饱和食盐水:在1000ml水中加食盐380g,比重约1.18。

饱和硫代硫酸钠溶液:在1000ml水中,加硫代硫酸钠1750g,比重在1.4左右。

此外还有饱和硫酸镁溶液,硫酸锌溶液等。

3.锦纶筛兜集卵法

取粪便5~10g,加水搅匀,先通过260μm40目)的铜丝筛过滤;滤下液再通过58μm260目)锦纶筛兜过滤,并在锦纶筛兜中继续加水冲洗,直到洗出液体清澈为止;尔后取兜内粪渣涂片检查。此法适用于宽度大于60μm的虫卵。在进行粪便检查时,对寄生于羊体内的寄生虫卵形态可参考图1-6-1~图1-6-8。

 

1-6-1                     图1-6-2

 

1-6-3                      图1-6-4

 

 

1-6-5                    图1-6-6

 

1-6-7                      图1-6-8

(三)幼虫检查法

适用于随粪排出的幼虫或粪便培养物、器官组织及土壤、饲料中的幼虫的检查。

方法:在固定于漏斗架上的漏斗下端接一根10~15cm长的胶皮管,其下端用止水夹固定。取10~20gg粪便放在漏斗里的金属网筛上,沿漏斗边缘缓缓加入40℃左右的温水,直到把粪便淹没为止,静置0.5~3h,幼虫从粪便中游出,沉于底部;小心打开止水夹,使底部的液体流入离心管内,离心沉淀1min,吸去离心管内的上层液,把底部的沉淀物摇匀,用滴管移至载玻片上,或全部倒入小平皿内,用放大镜或在低倍显微镜下检查有无活动的幼虫。检查时需计数发现的幼虫数目,用以估计动物受侵袭的程度。

二、血液内原虫检查法

一般用消毒过的针头自耳静脉或颈静脉采取血液。此法适用于检查血液中的梨形虫、住白细胞虫等。

(二)涂片染色标本检查

采血,滴于载玻片之一端,按常规法推制成血片,晾干,甲醇固定,而后用姬氏液或瑞氏液染色。染后用油浸镜头检查。本法适用于各种血液原虫。

1、姬氏染色法

取姬氏染色粉0.5g,中性纯甘油25ml,无水中性甲醇25ml。先将姬氏染色粉置研钵中,加少量甘油充分研磨,再加再磨,直到甘油全部加完为止。将其倒入60~100ml容量的棕色小口瓶中;在研钵中加少量的甲醇以冲洗甘油染液,冲洗液仍倒入上述瓶中,再加再洗再倾入,直至25ml甲醇全部用完为止。塞紧瓶塞,充分摇匀,而后将瓶置65℃温箱中24小时或室温内3~5天,并不断摇动,此为原液。

染色时,将原液2ml加到中性蒸馏水100ml中,即为染液。染液加于血膜上染色30min,后用流水冲洗2~5min,晾干,镜检。

染液应现用现配,染色效果最好(图1-6-9、1-6-10、1-6-11)。

  

1-6-9            图1-6-10             图1-6-11

2、瑞氏染色法

取瑞氏染色粉0.2g,置棕色小口瓶中,加入无水中性甲醇100ml,加塞,置室温内,每日摇4~5min,一周后可用。如需急用,可将染色粉0.2g,置研钵中,加中性甘油3ml,充分摇匀,然后以100ml甲醇,分次冲洗研钵,冲洗液均倒入瓶内,摇匀即成。

本法染色时,血片不必预先固定,可将染液5~8滴直接加到未固定的血膜上,静置2min,其后加等量蒸馏水于染液上,摇匀,过3~5min后,流水冲洗,晾干,镜检。

三、组织内原虫检查法

有些原虫可以在动物身体不同组织中寄生。一般在死后剖检时,取一小块组织,以其切面在载玻片上做成触片或抹片,染色后检查。抹片或触片可用姬氏染色法或瑞氏染色法。

泰勒虫病的病畜,常呈现局部的体表淋巴结肿大,采用淋巴结穿刺,抽取内容物,染色后,镜检。

家畜患弓形虫病时,生前诊断可取腹水,染色后,查找滋养体(照片1-6-1、1-6-2)。

 

照片1-6-1                     照片1-6-2

四、螨病检查法

(一)病料的采取

疥螨、痒螨等大多数寄生于动物的体表或皮内,因此应刮取皮屑,置显微镜下寻找虫体或虫卵(图1-6-12)。刮取皮屑的方法很重要,应选择患病皮肤与健康皮肤交界处,这里的螨较多。刮取时先剪毛,取凸刃小刀,在酒精灯上消毒,用手握刀,使刀刃与皮肤表面垂直。刮取皮屑时,应刮到皮肤轻微出血。

此点对检查皮内寄生的疥螨尤为重要。

蠕形螨病,可用力挤压病变部,挤出脓液,将脓液涂于载玻片上供检查。(图1-6-13、图1-6-14)。

(二)检查方法

1.直接检查法

在没有显微镜的情况下,可将刮下的干燥皮屑,放于培养皿内或黑纸上,在日光下曝晒,或用热水或炉火等对皿底或黑纸底面给以40~50℃的加温,经20~40min后,移去皮屑,用肉眼观察(如在培养中,在观察时则应在皿下衬以黑色背景),可见白色虫体在黑色背景上移动。此法仅适用于体形较大的螨,如痒螨。

2.显微镜直接检查法

将刮下的皮屑,放于载玻片上,滴加1滴煤油,覆以另一张载玻片,两片搓压使病料散开,分开载玻片,覆以盖玻片,置显微镜下检查。煤油有透明皮屑的作用,使其中的虫体易被发现,但虫体在煤油中容易死亡。如欲观察活螨,可用10%氢氧化钠溶液,液体石蜡油或50%甘油水溶液滴于病料上,在这些溶液中,虫体在短期内不会死亡。

除以上诊断方法外免疫学诊断用于寄生虫病免疫诊断的方法很多,其中,有些方法如酶联免疫吸附试验、间接血凝试验等,已在某些寄生虫病的生前诊断及流行病学调查中得到较为广泛的应用,为某些寄生虫病的早期诊断、流行病学调查乃至及时制订有效的防制措施提供了重要的科学依据。

还可以进行尸体剖检,可分为全身性剖检、个别系统剖检及个别器官剖检等。尸体剖检可以查明动物所有器官组织中的寄生蠕虫,包括生前诊断法所不能查出的虫体如不排虫卵的雄虫、幼虫等,并可做到病原蠕虫的计数与种类鉴别,因此,是寄生虫病确诊的重要依据,也是常用的寄生虫病流行病学调查和药物疗效考核的主要方法。通过尸体剖检,观察病理变化,查找病原体,判定感染的寄生虫种类和危害程度,分析致病和死亡原因,从而达到确诊的目的。

应当指出,生前诊断或尸体剖检查到病原体,但是不是由寄生虫引起的发病和死亡,还应该结合临床症状、流行病学资料和病理变化及虫卵、幼虫或虫体计数结果等进行综合判断。

五、线虫的虫卵形态

寄生线虫的虫卵一般为卵圆形,卵壳多为黄色、棕黄色或无色。卵壳主要是由三层组成:外层较薄,来源于受精卵母细胞的卵膜,称为卵黄膜或受精膜,由脂蛋白构成;中层较厚,称为壳质层,含壳质及蛋白质,能抵抗外界的机械压力,是卵壳的主要组成部分;内层薄,称为脂层或称蛔甙层,含脂蛋白和蛔甙,具有调节渗透作用的重要功能。既防止水溶性物质从外界渗入卵内,也防止卵内物质向外漏出。有些虫种,如蛔虫,当虫卵通过子宫时,卵壳外附加一层由子宫壁分泌的酸性粘多糖-鞣化蛋白复合物,称为蛋白质外膜。此层对虫卵水分的保持,防止过快干枯死亡有一定的作用。自人体内排出时,虫卵内细胞发育的程度因虫种而异,有的线虫卵内的细胞尚未分裂,如受精蛔虫卵;有的已分裂为数个细胞,如钩虫卵;有的则已发育为蝌蚪期胚,如蛲虫卵;有的虫种,虫卵内的胚胎在子宫内即发育成熟,自阴门排出时已为幼虫阶段,如丝虫。

常见线虫虫卵的鉴别

虫卵名称

大小(μm)

形状

颜色

卵壳

卵盖

内容物

受精蛔虫卵

45~75×35~50

宽椭圆

黄褐

很厚外有1层凹凸不平的蛋白膜

1个卵细胞

未受精蛔虫卵

88~94×39~44

长椭圆

棕黄

厚,蛋白膜较薄

许多大小不等的卵黄颗粒

钩虫卵

56~76×36~40

椭圆

浅灰

薄,卵壳与卵细胞间有明显间隙

分裂的卵细胞

蛲虫卵

50~60×20~30

不对称椭圆

浅灰

厚,一边较平,一边稍凸

折叠样幼虫

鞭虫卵

50~54×22~23

长椭圆

黄褐

厚,两端有透明栓

1个卵细胞

 

蠕虫卵与粪便中非虫卵物质的区别

 

虫卵

非虫卵

外形

有一定的形状

形状不固定

大小

有一定的大小范围

大小不定

颜色

少数无色透明,大多有固定颜色

无固定颜色

卵壳

光滑整齐,同种虫卵卵壳厚度一致

无卵壳构造,边缘不整齐

光泽

有固定的光泽和折光

无固定的光泽和折光

内容物

有固定的结构(如幼虫、毛蚴)和特征

无固定的结构和特征

 

 

 

 

 

 

 

 

检测技术简介
检测技术简介